Thuis
Contacten

    Hoofdpagina


Blastocyst van het embryo. De twee eigenschapen van ecs zijn: Self-renewal

Dovnload 87.19 Kb.

Blastocyst van het embryo. De twee eigenschapen van ecs zijn: Self-renewal



Pagina1/3
Datum30.04.2017
Grootte87.19 Kb.

Dovnload 87.19 Kb.
  1   2   3

Hematologie 2016

College #1 Dinsdag 12-04-2016

Introductie in stamcellen


Embryonale stamcel (ESC)

De embryonale stamcel is waar het allemaal begint. Je vindt ze in de blastocyst van het embryo. De twee eigenschapen van ECs zijn:



  1. Self-renewal – De mogelijkheid om ongelimiteerd te blijven repliceren.

  2. Pluripotent – Deze cellen kunnen nog alle celtypes vormen die je kunt vinden in het volwassen lichaam.


Asymmetrie

De stamcel deelt altijd asymmetrisch waarbij één cel een exacte kopie is van het origineel (Self-Renewal) en de ander heel veel gaat delen en differentiëren tot nieuwe celtypes.


Hoe de asymmetrie tot stand komt in de delen is nog niet duidelijk. Wel is inmiddels bekend dat de lang gedachte immortal strand hypothesis niet op gaat. Deze hypothese ging er vanuit dat de kopie van de stamcel altijd de originele DNA strands behield, waardoor er minder kans was op mutaties. Dit laat echter ook geen ruimte open voor evolutie. Voor nu lijkt het random te zijn of het nieuwe of oude DNA van een chromosoom in de nieuwe stamcel terecht komt. Er kunnen intrinsieke en extrinsieke factoren zijn die ook een rol spelen.

De embryonale stamcel komt alleen voor in het embryo en vormt adulte stamcellen (ASC). Hiermee verandert de stamcel van pluripotent  multipotent. De cel kan niet meer alle celtypes vormen, alleen binnen een bepaald type. Er zijn heel veel verschillende ASCs. Een paar voorbeelden zijn:



  • Hepatic stem cell

  • Pancreatic stem cell

  • Neural stem cell

En de hematopoietische stamcel (HSC) waar het hier voornamelijk over zal gaan. Het is de voorloper van al onze bloedcellen.
Kweken van stamcellen

Het kweken van stamcellen is interessant voor onderzoek en therapeutische mogelijkheden. Het is moeilij kom ASCs te kweken, maar ESCs kunnen we tegenwoordig wel kweken met verschillende methoden.


1. Uit de blastocyst halen.

Wanneer de embryo zich ontwikkeld komt er het stadium van de blastocyst. Er zijn dan tussen de 64-100 cellen en er is een inner cell mass gevormd. Embryonale stamcellen bevinden zich hier en kunnen in dit stadium uit het embryo geïsoleerd worden.

Nadelen zijn de ethische bezwaren. Ook is het niet patiënt specifiek en zal er snel afstoting plaatsvinden.

2. Nucleaire transfer.



Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) is het proces waarbij de nucleus van een somatische cel van de patiënt wordt geïsoleerd en vervolgens wordt ingebracht in een eicel. Vervolgens kunnen de ESCs worden geïsoleerd en deze zijn wél patiënt specifiek.


3. induced Pluripotent Stem Cell



iPS is een nieuwe techniek waarbij er 3/4 transcriptie factoren worden toegevoegd aan een gewone somatische cel/ASC en vervolgens gaat de cel ‘terug’ naar het stadium van een pluripotente stamcel, dus hetzelfde level als embryonale stamcellen. Dit biedt veel kansen voor het creëren van nieuwe weefsels, gen therapie maar ook als onderzoeksmiddel voor ziektes en medicijnen.
Het probleem is echter dat het terugplaatsen moeilijk gaat.
Hematopoietische stamcel

Het isoleren van de HSC zelf, in plaats van het creëeren van nieuwe, is ook een goede optie voor onderzoek en therapie. Je vindt deze HSCs op 3 plekken:



  • Het beenmerg

  • Gemobiliseerd in het bloed (na toediening van groeifactor, G-CSF)

  • Navelstreng bloed

Omdat het moeilijk is om genoeg cellen te verkrijgen moeten ze na isolaties geamplificeerd worden. Het is echter moeilijk om ze te tellen. Dit kan op twee manieren gedaan worden>

In vivo; Je brengt de cellen in in een xenograft muis (zonder immuunsysteem) en laat de cellen ontwikkelen. Vervolgens breng je antilichamen in die de menselijke (stam)cellen kunnen kleuren waardoor je ze kunt onderscheiden van de muizencellen. Nu kun je zien hoeveel cellen er gevormd zijn en daaraan afleiden hoeveel stamcellen er in je mix zitten.

In vitro; Je brengt alle cellen in een medium waarin alleen stamcellen kolonies kunnen vormen. Je laat het 5 weken groeien. Vervolgens breng je dit mengsel over in 96-well plates en laat je er berekeningen op los die je vertellen hoeveel stamcellen er dan in je mengsel zitten.

Het kweken van de HSC lukt niet goed omdat de natuurlijke omgeving niet goed is na te bootsen.
Ontwikkeling van de HSC





Niche

De HSC is te vinden in het beenmerg. De niche hier is erg belangrijk voor het stimuleren van deling en het sturen van de differentiatie. Er liggen ook ‘supporting cells’ die het delen van de stamcel mogelijk maken. Er zijn ook heel veel receptoren en cytokines die een rol spelen in deze niche. Het is van belang om hier meer over te weten om optimale groeicondities na te kunnen bootsen in vitro.


iPS naar HSC

Dus de beste mogelijkheid momenteel lijkt het creëren van nieuwe bloedcellen vanuit de iPS. Er zijn drie hoofdmanieren om de stamcel te laten differentiëren tot hematopoietische cellen.



  1. Embryoid body (EB) formation

Dit is de manier van ‘hanging drops’. Je pipeteert druppels op de deksel van een petrischaaltje en voegt de iPS cellen hier aan toe. Samen met de juiste groeifactoren kunnen de cellen nu groeien in de druppel en differentiëren.

  1. Coculture

Het uitplaten van ESCs en stromacellen die hematopoietische differentatie stimuleren.

  1. Colony formation in medium

De cellen toevoegen aan een medium (methylcellulose) met de juiste cytokines en deze laten groeien en later uitplaten.

Het creëren van HSCs is dus mogelijk, helaas werken ze in vivo niet. Bij terugplaatsing zijn ze niet functioneel. Dit wordt geprobeerd te stimuleren met bepaalde transcriptie factoren, maar dit is geen natuurlijke situatie en voor therapie doeleinden dus nogsteeds ongeschikt.


Embryonale ontwikkeling

In de embryonale ontwikkeling begint het voor de HSC allemaal in de aorta. Daarna migreren deze cellen naar de lever. Pas vlak voor de geboorte nestelen ze in het beenmerg waar ze blijven voor de rest van hun leven. Dit process doet denken dat er een soort rijping door verschillende plekken nodig is en dit kunnen factoren zijn die van belang zijn in het kweken van functionele HSCs.


Teratoom

Een andere manier om functionele HSCs te verkrijgen is via een teratoom – een tumor die bestaat uit verschillende soorten weefsels, omdat deze ontstaan is uit een stamcel. Als je een stamcel op een verkeerde plek inbrengt dan vormt zich daar een tumor. De stamcel vormt allerlei weefsels die zich verzamelen in zo’n tumor, van epitheel tot tand. Als je uit al deze type weefsels de HSCs isoleert en opnieuw inbrengt dan zijn deze HSCs wél functioneel. Dit is echter niet een geschikte manier om in mensen toe tepassen.


Epigenetica

Iets wat ook van belang is, is de epigenetica. Dit is vooral nog problematisch bij de iPS cellen. Deze worden gecreeërd vanuit type weefsels zoals spier, huid, long weefsel. Vervolgens worden zij terug gevormd naar stamcellen. Toch als je deze cellen beter gaat bekijken hebben zij nog de epigenetische markers van de originele cel waar ze uit ontwikkeld zijn. Er is dus meer dan alleen gentranscriptie aanpassen met transcriptie factoren nodig.




De tumor stamcel

Leukemie is een kanker waarbij er tekort is aan uitgerijpte functionele bloedcellen. Het idee is dat er in de leukemie situatie ook een hyrarchie heerst, net als in de normale situatie. Met een leukemische (tumor) stamcel die aan self-renewal doet. Deze kan vervolgens snel delende dochtercellen produceren. Het probleem bij leukemie is dat de ziekte vaak terugkeert na enkele jaren, en deze leukemische stamcel is mogelijk de oorzaak. Chemotherapie pakt de sneldelende cellen aan waardoor de tumor verdwijnt. Deze langzaam delende stamcellen worden echter dan vaak niet aangetast en het proces kan zich opnieuw ontwikkelen.


Asymmetrie in SC deling

Er wordt naar verklaringen gezocht voor de asymmetrische deling van een stamcel en er meerdere mogelijkheden.

Het kan mogelijk te maken hebben met het mRNA dat in een cel wordt geproduceerd. Wellicht is een van de twee dochtercellen van een stamcel beter in staat dit mRNA te transleren tot eiwitten. Hierdoor zou de cel geschikter kunnen zijn om te differentiëren en delen. De andere cel blijft dan stamcel.
Een andere optie is de niche. De niche van de HSC is in het beenmerg en hier heersen hele andere condities dan op andere plekken. Een belangrijk punt is dat er bijna geen 02 en dus ook weinig ROS is op deze plek. Dit kan de stamcel sterk beïnvloeden en dus ook het delingsproces. Er zijn nog veel meer omgevingsfactoren, zoals transcriptie factoren en cytokines die er worden afgegeven.
Ook een goede mogelijkheid is de asymmetrische deling die beïnvloed wat er met de dochtercel gebeurt. Wanneer de cel deelt kan de richting sterk van belang zijn. De drie voorbeelden hieronder geven aan hoe dit kan. Door in verbinding te staan met de niche blijft een cel een stamcel. Als de cel naar de zijkant deelt creërt dit twee stamcellen. Deelt hij recht omhoog blijft een stamcel de andere wordt een dochtercel. Ook bij een schuine deling kunnen er twee dochtercellen ontstaan.

Receptoren in de niche kunnen de cel dan zo beïnvloeden dat de centrosomen zich verplaatsen naar een bepaalde plek in de cel. Vanuit de centrosomen worden de chromatiden uitelkaar getrokken en dus wordt de richting van celdeling bepaald.




College #2 woensdag 13 April.

Hematopoiesis & leukemie ontwikkeling


Hematopoiesis – Het vormen van nieuwe bloedcellen in een levend organisme.

In een normale toestand wordt er in de mens wel zo’n 1011 nieuwe bloedcellen per dag gevormd. Het begint allemaal bij de hemapoietische stamcel. Deze deelt en vormt een multi-potente voorloper cel (MPP).

De MPP is net zo potent als de HSC, maar deze kan niet aan self-renewal doen en leeft dus maar ~2 weken, in tegenstelling tot de HSC. Deze MPP differentieert zich tot twee verschillende cellen;


  • CLP – Comitted Lymphoid Progenitor. Deze zal alle lymphoide cellen vormen

  • CMP – Commited Myeloid Progenitor. Deze vormt alle myeloide cellen.



Niche

De cellen worden allemaal geproduceerd in het beenmerg, dit is hun niche. In deze niche liggen de niche cellen die communiceren welk type bloedcel op dat moment (extra) moet worden aangemaakt. De regulatie van aanmaak  ontwikkeling  apoptose moet zeer nauwkeurig gedaan worden, anders kan er leukemie ontstaan.


Hematopoiesis

We hebben zo’n 20.000 HSCs, toch blijkt het dat er hiervan maar ~1000 HSCs bijdragen aan de hematopoiese. De overige 19.000 doen alleen aan self-renewal. De manier waarop de 1000 HSCs alle nieuwe cellen is nog niet bekend. Er zijn verschillende opties mogelijk.




  1. De HSCs maken omstebeurt een lading aan nieuwe cellen aan

  2. De HSCs maken tegelijkertijd een stabiele lading aan cellen aan.

  3. Er zijn pieken in bepaalde HSCs die dan meer cellen gaan produceren en deze pieken volgen elkaar op.

  4. Het is totaal random wanneer welke HSC nieuwe cellen aanmaakt.


Differentiatie

Het proces van differentiatie hangt af van verschillende factoren. Er zijn stofjes die het proces beïnvloeden en welke cellen er ontstaan hangt dan af van de levels van deze stoffen.

Het is een random proces dus, waarbij een hoeveelheid stof bepaalt wat voor cel er wordt gemaakt. Toch is er controle want de omgeving wordt gestimuleerd door bepaalde factoren en reageert daar op met cytokines die nodig zijn voor de juiste differentiatie.

Leukemie

Als het mis gaat met de regulatie kan er leukemie ontstaan. Dit wordt in verschillende groepen ingedeeld. Leukemie kan Acuut of Chronisch zijn. Daarnaast maken we onderscheid tussen lymphoide en myeloide leukemie. Zo krijg je bijvoorbeeld; Acute lymphoide leukemie (ALL) of Chronische myeloide leukemie (CML).

Een of meerdere bloedcel types worden in het geval van leukemie niet meer (correct) geproduceerd. Je hebt dan een ophoping van infunctionele cellen en tekort aan functionele cellen.
Leukemische stamcel

Er wordt gedacht dat er in de situatie van leukemie net zo’n hyrarchie heerst als in de functionele hematopoiesis. Er is dus wellicht een leukemische stamcel die aan self-renewal doet en oneindig kan delen. Deze produceert dan een voorloper cel die leukemische blasten produceert.

Leukemie is een ziekte die vaak terugkeert en dit kan verklaard worden met de stamcel. Chemotherapie pakt namelijk alleen sneldelende cellen aan, en deze leukemische stamcel kan de therapie dus overleven. Na enkele jaren kan deze dan weer nieuwe kankercellen produceren.
Er zijn verschillen en overeenkomsten tussen de HSC en LSC.

Zo ondergaan beide self-renewal en delen ze niet vaak/langzaam, het verschil zit hem waarschijnlijk in de regulatie van het proces. De LSC is ongevoelig voor chemotherapie en dit is mogelijk door verhoogde MDR expressie. Daarnaast zijn er verschillende markers die alleen op de LSC tot expressie komen of juist op beide. Uiteindelijk komt het er op neer dat het proces van differentiatie anders loopt in de LSC dan in de HSC.


Mutaties

Er wordt gedacht dat de ontwikkeling van leukemie ontstaat door ‘multiple hits’. Dus er is een opstapeling van mutaties nodig om tot leukemie te komen. Deze mutaties moeten belangrijke eigenschappen van de cel veranderen, namelijk de self-renewal, overleving en proliferatie van de gewone cel moeten veranderd worden.

Er wordt onderscheid gemaakt in twee soorten mutaties:

Driver mutations – Mutaties die (samen) de ziekte werkelijk veroorzaken door dingen in een cel te veranderen die bijdragen aan het ziekteproces.

Passenger mutations – Mutaties die optreden, maar de ziekte en het ziekteproces verder niet beïnvloeden.
Er is meer bekend over mutaties die veel voorkomen, maar er moet wel geconcludeerd worden dat dit ook driver mutations zijn. Veel voorkomend in AML zijn mutaties in FLT2, NPM1 of DNMT3A.

Als een mutatie in een bepaald gen werkelijk een driver mutatie is dan zijn er nog twee opties.

Een Required mutation – Een mutatie die bijdraagt aan het ontstaan van leukemie. Het kan ook een Sufficient mutation – Deze mutatie is op zichzelf voldoende om de ziekte (leukemie) te veroorzaken.
Onderzoeks modellen

Een belangrijk deel van nieuwe kennis verkrijgen over iets, is het kiezen van de jusite modellen. Iets wat in leukemie veel gedaan wordt is in vitro assays. Het uitplaten van cellen uit een monster op stromale cellen van het beenmerg. Tussen deze cellen kunnen leukemische stamcellen en gewone stamcellen zitten die hier kunnen groeien. Je laat dit zo’n 5-7 weken staan en vervolgens kun je kijken naar wat is gegroeid. Met een microscoop kun je type cellen van elkaar onderscheiden.

Ook in vivo kunnen er onderzoeken gedaan worden in muis of mens. Je kunt ook menselijk materiaal transplanteren in een muis (xenograft) zonder immuunsysteem. Het is altijd belangrijk dat je goed kijk naar wat voor controels je kiest.
Een belangrijk onderzoeks model is het vormen van knock-out of knock-in modellen. Hierbij kun je dus een gen uitzetten, of juist extra toevoegen, om vervolgens de effecten te bekijken. Een nieuwe en veelbelovende manier om dit te doen is CRISP/Cas9. Dit is een methode waarbij er in het DNA wordt geknipt in jouw gewenste gen. Er onstaat een dubbelstrands breuk en deze moet opgelost worden. Bij het repareren kan er een mutatie ontstaan en dit leidt vaak tot een vervroegd stopcodon in het eiwit waardoor het gen niet meer functioneel is.

Er kan zelfs een extra stuk DNA aan toegevoegd worden die werkt als template voor homologe recombinatie en op deze manier kan er met CRISP/Cas9 iets worden ingebouwd.


Een andere methode is RNAi – RNA interference. Hierbij produceer je kleine stukjes RNA, siRNA die complementair zijn aan jouw gewenste mRNA. Het zorgt voor blokkering van translatie van mRNA  eiwit. Hiermee creeër je niet een knock-out maar een knock-down muis met verminderde expressie van jouw gen van interesse.
PU.1

PU.1 is een gen wat van belang is voor de differentatie van de bloedcellen. Voornamelijk voor het produceren van B-cellen en macrofagen.

Onderzoek hier naar met:

YFP – Yellow Fluorescent Protein. Dit werd achter het PU.1 gen geplakt en al het geproduceerde PU.1 kleurde daarom geel. Je kan dan bekijken waar in de cel PU.1. tot expressie komt.

Knock-Out produceren. Een muis is echter niet levensvatbaar als PU.1 vanaf het begin wordt uitgeknockt. Daarom kun je gebruik maken van LoxP en Cre. LoxP sites zitten om je gen van interesse heen en recombinase Cre knipt precies op deze sites, zodat je gen in het midden er uitgehaald wordt.

Je kan deze twee dingen zelfs combineren waardoor je kan volgen wat er waar in de cel gebeurt wanner er wel en niet wordt uitgeknocked.
Hieruit bleek dat totale deletie van PU.1 niet to leukemie leidt, maar gedeeltelijke knock-down van het gen wél AML veroorzaakt. Het komt er op neer dat er een goede balans moet zijn tussen alle TFs die diffferentiatie beïnvloeden, omdat er anders leukemie kan ontstaan.
We have discussed:

Concepts

HSCs vs. LSCs

Self-renewal vs. differentiation

Clonal hematopoiesis and aging

Models to use in studying hematopiesis

in vitro vs. in vivo assays



human vs. mouse

Required vs. sufficient

Molecular techniques

Overexpression vs. knockout vs. knockdown

Constitutive vs. inducible systems

Highlighted research examples

College #3 Donderdag 14 April

Chronische myeloïde leukemie


Er zijn twee hoofdtypes leukemie die we onderscheiden, met elk daarin hun eigen subtypes.

  1. Acute leukemie

    • Acute myeloïde leukemie (AML)

    • Acute lymfatische leukemie (ALL)

  1. Chrnoische leukemie

    • Chronische lymfatische leukemie (CLL)

    • Chronische myeloïde leukemie (CML)

    • Hairy cel leukemie (HCL)

    • Lymfatische/myeloïde/monocytaire leukemieën (zeldzaam)

Het verschil hierin is dat bij acute leukemie er onrijpe cellen zijn en deze zijn dus niet functioneel. Bij chronische leukemie is er een te veel aan cellen, maar deze cellen kunnen nog best functioneel zijn.

In beide gevallen is de normale ontwikkeling van bloedcellen verstoort.
Chronische leukemie

In chronische leukemie is er sprake van extreme deling van de voorloper bloedcellen. Deze cellen kunnen nog wel differentiëren en uitrijpeen, maar door de hoeveelheid is er een vergroot aantal witte bloedcellen. Dit kan als gevolg hebben;



  • Leukocytose

  • Hypercellulair beenmerg

  • Vergrote milt


Symptomen

De symptomen van CML betreffen:



  • Vermoeidheid door de te weinig goed functionerende rode bloedcellen. Ook gaat er heel veel energie naar de aanmaak van al die extra cellen.

  • Buikpijn door de sterk vergrote milt. Ook leidt dit tot druk tegen de lever  druk tegen de maag  minder eetlust  afvallen.

  • Bloedingsneiging

  • Stroperigbloed, wat leid tot bloedpropjes.


Ziektebeeld

Het is een ziekte die veel voorkomt op middelbare leeftijd. Er is (vaak) sprake van veel te veel witte bloedcellen in het bloed. Ook kunnen voorloper cellen ineens in het bloed voorkomen, waar ze niet horen.

Het verloop van de ziekte is als volgt.

Chronische Fase In deze fase is er een teveel aan uitgerijpte (witte) bloedcellen.


Geacceleerde fase Vervolgens kan er veel meer gedeeld worden in het beenmerg.

Er is een opstapeling aan fouten.



Blastencrisis Door deze fouten ontstaan er blasten (niet functionele cellen) ipv

De rijpe cellen. Dit is de blastencrisis.


2e Chronische fase

Blasten crisis

Dood

Oorzaak

Een translocatie tussen chromosoom 9 en chromosoom 22 t(9;22) is een zeer karakteristieke cytogenetische afwijking in CML. Er is dan een verkleind chromosoom 22, ook wel bekend als het philadelphia chromosoom. En het BCR-ABL gen wordt hier gevormd. Daardoor ontstaat er een fusie eiwit met tyrosine kinase activiteit. Dit verandert de functie in de stamcel en leidt tot de ontwikkeling van CML.


Therapie

Het doel van behandeling van CML is het behandelen van de symptomen, het uitroeien van CML cellen bij de bron. Hiermee wil je natuurlijk de patiënt genezen. Je test de hematologische respons – na behandeling alle bloedwaardes weer normaal.



Fusie eiwit

Het fusie eiwit zorgt dus voor verhoogde tyrosine-kinase activiteit. Normaal zijn er signaal moleculen die binden aan de tyrosine kinase receptoren. Vervolgens kunnen de interne tyrosine domeinen gefosforyleerd raken  Dit geeft het signaal door en eiwitten worden geactiveerd  De cel reageert en er worden meer rode- of juist witte bloedcellen geproduceerd.

In CML is er sprake van verhoogde witte bloedcel levels en een nieuwe therapie zou wellicht geschikt zijn als deze hier kan ingrijpen, op receptor niveau.

Dat kan met Imatinib. Dit is een blokker die gaat zitten op de ATP bindingsite. Hierdoor is er geen fosforylatie mogelijk en wordt het proces dus afgeremd. Om te kijken of imatinib werkt in CML patiënten moet er onderzoek gedaan worden in veel stappen.




  1. In vitro

Imatinib kan getest worden op cellijnen. Hieruit blijkt dat toediening van Imatinib celdeling remt in cellijnen die positief zijn voor Bcr-Abl. Het werkt niet in de Bcr-Abl negatieve cellen, maar dat is ook niet wat wordt verwacht.


  1. In vivo

Het zou getest moeten worden op dieren eerst. Helaas is dit (nog) niet mogelijk want er is geen geschikt profdiermodel.


  1. Patiënten

Dan moet er getest worden op patiënten en dat gaat in 3 fases.
  1   2   3

  • Hematologie 2016 College 1
  • Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)
  • Het beenmerg Gemobiliseerd in het bloed
  • Het kweken van de HSC lukt niet goed omdat de natuurlijke omgeving niet goed is na te bootsen.
  • Embryoid body (EB) formation Dit is de manier van ‘hanging drops’
  • Coculture Het uitplaten van ESCs en stromacellen die hematopoietische differentatie stimuleren. Colony formation in medium
  • College 2
  • CLP
  • Acuut of Chronisch
  • Required mutation
  • RNAi – RNA interference.
  • We have discussed: Concepts HSCs vs. LSCs Self-renewal vs. differentiation Clonal hematopoiesis and aging
  • Required vs. sufficient Molecular techniques Overexpression vs. knockout vs. knockdown Constitutive vs. inducible systems
  • Acute leukemie Acute myeloïde leukemie (AML) Acute lymfatische leukemie (ALL) Chrnoische leukemie
  • Chronische Fase
  • Blasten crisis Dood
  • Imatinib.

  • Dovnload 87.19 Kb.