Thuis
Contacten

    Hoofdpagina


Samenvatting Metabolisme en Toxicologie Esmee Castermans College 1 (23 feb)

Dovnload 277.62 Kb.

Samenvatting Metabolisme en Toxicologie Esmee Castermans College 1 (23 feb)



Pagina4/6
Datum13.11.2017
Grootte277.62 Kb.

Dovnload 277.62 Kb.
1   2   3   4   5   6

College 4 (26 feb)
Oxidatieve stress = Disbalans tussen de vorming van reactieve zuurstof intermediairen (reactive oxigen species, ROS) en de werking/aanwezigheid van antioxidanten.

Normaal gesproken ligt de balans aan de kant van antioxidanten en hebben we geen last van ROS, maar geneesmiddelen kunnen die balans een beetje verschuiven en zo kan je wel last krijgen van ROS. Diclofenac is een voorbeeld van zo’n geneesmiddel.


Gevolgen:

  • Sub-cellulair: Schade aan eiwitten, DNA en lipiden en verstoring van signaaltransductie en genregulatie.

  • Cellulair/weefsel niveau: Celdood (door apoptose of necrose) / functieverlies / mutaties.

  • Organisme niveau: Tumoren (kanker) of degeneratieve ziekten.

ROS: chemisch reactieve moleculen die zuurstof bevatten. Zuurstof zelf (O2) en water (H2O) zijn zelf niet reactief, maar alles ertussenin wel.


ROS hebben een verschillende halfwaardetijd. Hoe korter de halfwaardetijd, hoe reactiever. Van reactief naar minder reactief:

ONOO- (peroxynitrite)

NO (nitric oxide radical)

1O2 (singlet oxygen)

O2- (superoxide anion)

H2O2 (hydrogen peroxide)

ROO (peroxyl radical)

RO (alkoxyl radical)

HO (hydroxyl radical)


ROS productie:

Endogeen


  • Het ontsnapt uit elektronen transportketen.

  • Bijproduct van de enzymactiviteit: chytochroom P450, xantine oxidase, etc.

  • Geactiveerde macrofagen, lymfocyten, etc.

  • Laatste 2 puntjes: gewone endogene processen, maar door beïnvloeding van lichaamsvreemde stoffen kunnen deze processen versterkt worden.

Exogeen

  • Redox-cycling (metabolieten van) xenobiotica: quinonen, radicalen

  • Interferentie met de elektronen transportketen van xenobiotica

  • UV

Endogene productie van ROS.

In het celmembraan zitten lipoxygenase en NADPH oxygenase complex.

Dit zorgt voor productie van peroxide, superoxide anion en hydoxyl radicalen.


Semiubiquinone als endogene ROS producent:

Semiubiquinone heeft een reactieve O. Deze kan zijn elektron afgeven aan O2 in de elektronen transport keten en zo wordt er een reactieve zuurstof gevormd.


CYT-P450 als endogene ROS producent:

P450-Fe2+---O2  P450-Fe3+ + O2- + S

S

Als dit gebeurt, is de O niet gekoppeld aan de je substraat en is de reactie dus eigenlijk mislukt. Hierbij ontstaat ook een reactieve zuurstof. De superoxide anion radicalen laten los uit een elektron gereduceerd peroxy-CYP complex. Ook kan er waterstof peroxide loslaten uit twee elektron gerecuceerde peroxy-CYP complexen na protonering.



Er zijn dus 2 plekken in deze cyclus waarbij een ROS vrijkomt!

Het ene type CYP isoenzym laat makkelijker ROS los dan het andere type.


Exogene ROS vorming door metabolisme van een quinone.

-quinone als uitgang: reactief en redox-actief

Elektronen van NADPH worden overgezet op de zuurstof van een quinone. Uiteindelijk lekken alle elektronen door redox-cycling naar de zuurstof van de quinone. De O van quinone is dan reactief en dit geeft zijn elektronen af aan O2, waardoor deze reactief wordt. Dit is schadelijk. Ook maakt deze cyclus alle NADPH op, die voor andere celprocessen nodig is en maakt het de antioxidanten op. Het is dus op 3 manieren schadelijk.
ROS vorming door interferentie met de elektronen transport keten:

Bijv. doxorubicine. Ook hierbij doneert NADPH elektronen en worden O’s reactief gemaakt. Zuurstof wordt hierdoor geactiveerd.


Hoe kan een xenobioticum ROS productie stimuleren?

  • Door inductie van CYPs (vooral 2E1)  ROS productie door ontkoppeling.

  • Door in de mitochondriën elektronen uit de elektronentransport keten op te vangen en door te geven aan zuurstof (bijv. doxorubicine)

  • Door redoxcycling elders met behulp van CYTP450 reductase dat steeds weer elektronen aanlevert. (bijv. benzoquinone)

  • Door op een andere manier cellen te beschadigen, waardoor het immuunsysteem geactiveerd wordt.


Detoxificatie van ROS: antioxidanten
Superoxide dismutase (SOD) katalyseert de detoxificatie reactie van ROS. Hij voegt twee superoxides samen met 2 H+ en vormt zo H2O2. Dit is ook een ROS, maar deze is al een stuk minder gevaarlijk.

Het tweede deel van de reactie wordt uitgevoerd door glutathion peroxidase of catalase.

Glutathion peroxidase zet H2O2 met 2 GSH om in 2 H2O en een O2.

Catalase zet H2O2 om met een tweede H2O2 in 2 H2O en een O2.


Fenton reactie: toxificatie

Wanneer de H2O2 niet snel genoeg wordt weggevangen, gebeurt dit. Er worden een HO En een OH- gevormd.


Ook kan de O2- binden met NO voordat SOD het omzet. Er wordt dan NO2 en CO3-• gevormd.
Detoxificatie met behulp van vitamine E:

Vitamine E is een vetoplosbaar vitamine. Het detoxificeert ROS dus in de membranen. Het zorgt voor detoxificatie van lipid-radicalen. Vit E wordt hier zelf radicaal van. GSH zorgt ervoor dat dit vit E radicaal wordt omgezet in glutathion disulfide.


De rol van glutathion (GSH) bij de bescherming tegen celschade. (kennen!)

  • Detoxificatie van radicalen

  • Detoxificatie van H2O2 (met behulp van glutathion-S-peroxidase)

  • Reductie van protein-S-S-X

  • Conjugatie van reactieve metabolieten met behulp van glutathion-S-transferase (GST).

Dit zijn 4 hele belangrijke eigenschappen van glutathion!

Ook zorgt het voor een gereduceerd milieu en heeft het een hoge intracellulaire concentratie.


Detoxificatie van chlopromazine radicaal door GSH:

H2O2 wordt door POD en GR omgezet. Hierbij wordt uiteindelijk NADP+ gevormd.


Thioltransferase is samen met GSH belangrijk bij de detoxificatie van radicale eiwitten. Bij radicale eiwitten is er een S-S brug gevormd tussen 2 SH groepen. Thioltransferase en GSH samen kunnen S-S bruggen verbreken en het eiwit zo weer herstellen naar zijn oorspronkelijke vorm.
Glutathion is een vrij stabiele stof en wordt niet snel in het lichaam afgebroken. Daar zijn namelijk speciale enzymen voor nodig en die bevinden zich niet in de darm.

Schade door ROS:



  • lipide peroxidatie

    • membraanschade

    • vorming van reactieve aldehydes

  • DNA schade

    • Mutaties

    • Strengbreuk

  • Schade aan eiwitten: oa oxidatie –SH

    • Verlies van functie

    • Afbraak gestimuleerd door HSP’s

    • Cytotoxiciteit van eiwitaggregaten

  • Interferentie met signaaltransductie en genregulatie

    • Ontstekingsreactie

    • Apoptose

    • Adaptatie!

Behalve bij detoxificatie leidt ROS altijd tot apoptose van de cel.


Cyto-protectie wordt geïnduceerd door ROS (adaptatie).

Dit is om een kleine verhoging in ROS aan te kunnen.

Op Nrf2 zit Keap1 die Nrf2 remt. Wanneer Keap1 ROS opmerkt, laat het los van Nrf2 en valt te rem op Nrf2 weg. Nrf2 gaan vervolgens allerlei genen opwaarderen. Deze genen coderen voor antioxidanten en enzymen die betrokken zijn bij detoxificatie.
Het ontstaan van membraanschade (lipide peroxidatie):

Meervoudig onverzadigde vetzuren: de radicalen kunnen protonen uit de dubbele bindingen halen. De vetzuren worden dan lipide radicalen en binden een zuurstof, die dus ook radicaal wordt. om dit op te lossen pakt hij een proton van een ander membraanlipide en oxideert hij zichzelf. (oxidatie is minder erg dan een radicaal zijn, maar het is nog steeds niet goed voor het lipide). Na een tijdje is het hele membraan geoxideerd omdat de lipiden het radicaal steeds doorgeven. Ook worden er toxische monodialdehydes (TBAR’s) gevormd.


Carcinogenese:
Kanker is een ongeremde (relatief autonome) proliferatie (neoplasme) van een somatische cel, resulterend in een tumor die benigne (adenoom) of maligne (carcinoom, sarcoom) is. Het wordt gekarakteriseerd door een verlies van groeicontrole.
Een carcinogeen veroorzaakt:

  • Toename van het aantal tumoren

  • Ongebruikelijke tumoren

  • Versnelde tumorvorming

  • Toename van het aantal verschillende tumoren.

Een stof is carcinogeen (IARV definitie) als hij kwaadaardige tumoren induceert.


Carcinogenen kunnen verschillende dingen zijn die structureel heel veel van elkaar kunnen verschillen:

  • natuurlijke stoffen

  • xenobiotica, incl. geneesmiddelen

  • virussen

  • straling

genetische predispositie:



  • deficiëntie in de reparatie

  • deficiëntie in de (de)toxificatie

  • deficiëntie in de apoptose

Geneesmiddelen kunnen carcinogeen zijn.

Er is een classificatie van geneesmiddelen op het gebied van carcinogeniteit.


  • 1: bewezen carcinogeen in de mens. Dit zijn er niet heel veel.

  • 2A: waarschijnlijk carcinogeen. Bij het dier wel, bij de mens waarschijnlijk ook.

  • 2B: mogelijk carcinogeen. Bij het dier wel, maar bij de mens is er onvoldoende data.

  • 3: onbekend = niet geclassificeerd. Er is onvoldoende data.

  • 4: bewezen niet-carcinogeen (hoewel dit natuurlijk bijna onmogelijk te bewijzen is.)

De classificatie wordt gedaan door middel van epidemiologisch onderzoek en blootstelling van grote groepen mensen.
Voorbeelden van carcinogene stoffen:

  • Beta-propiolactone

  • 1,2-dimethylhydrazine

  • Vinyl chloride

  • Benzoapyrene  er komen OH groepen aan of er wordt een epoxide gevormd. Dit is te voorspellen omdat er zo veel benzeenringen aan zitten.

  • Thioacetamide

  • Safrole

Deze stoffen hebben hele verschillende structuren.
IARC klasse 1 voorbeelden

  • Geneesmiddelen:

    • Tamoxifen  tegen borstkanker. Kans op genezing is groter dan de kans dat je later weer kanker krijgt hierdoor.

    • Diethylstilboestrol

    • Chiclosporine  immuun afweer tegengaan bij orgaantransplantatie.

    • Chlorambucil

Bij al deze geneesmiddelen geldt dat hun voordelen opwegen tegen de kans op carcinogeniteit.

  • Overig

    • Alcohol

    • Asbest

    • Roken

Genotoxische carcinogenen (mutageen): gaan interactie aan met DNA met als gevolg schade aan of verandering in de structuur.

Men neemt aan dat er van genotoxische carcinogenen geen NOAEL is, omdat 1 enkel molecuul al kanker kan veroorzaken. Je mag er dus helemaal niet aan blootgesteld worden. Nicotine is zo’n mutageen. De tumorigeniciteit is afhankelijk van de dosis.


Non-genotoxische carcinogenen (non-mutageen): Stoffen die op andere wijze carcinogeen zijn. Er is verandering van DNA expressie, maar zonder DNA structuur verandering. Er is een treshold en het proces is reversibel. De tumorgeniciteit is dus dosis afhankelijk. Ze kunnen zorgen voor promotie van tumorgroei, maar ze leiden niet tot directe DNA schade. Deze stoffen zijn soort-, cellijn- een weefselspecifiek. Er zijn species verschillen. Een stof zal bij de ene soort wel en bij de andere soort niet omgezet worden.
Goedaardige tumoren (benign)

  • omkapseld

  • niet invasief

  • niet metastaserend

Kwaadaardige tumoren (malignant)

  • niet omkapseld

  • invasief

  • metastaserend


3 stadia van carcinogenese:

  1. Nadat er DNA schade is ontstaan wordt een cel een initiated cell, dus fase 1 is de initiatie. Initiatie is irreversibel. Er is vaak DNA schade door genotoxische carcinogenen. Vaak zijn er meerdere mutaties in de genen nodig die van belang zijn voor de regulatie van de celdeling.

  2. Deze cel gaat zich proliferen (tenzij er apoptose plaatsvindt) en wordt een focale lesie. Fase 2 is dus de promotion. Het gebeurt door non-genotoxische (epigenetische) carcinogenen.

  3. De cellen gaan verder prolifereren (ongeremd) en er ontstaat kanker. Fase 3 is de progression. Dit leidt tot verandering van het fenotype, snelle groei, verlies van groeicontrole, invasie, metastase, angiogenese en remming van de apoptose.

Eerst moet de initiator aanwezig zijn en daarna moet de promotor komen. Er mag niet te veel tijd tussen de promotors zitten.


Binding van een stof aan het DNA leidt tot kanker. Hoe kan dat?

2 Hypotheses voor het ontstaan van kanker:



  • Initiatie in de normale somatische, gedifferentieerde cel.

  • Initiatie in een multipotente stamcel.

    • Verlies van asymmetrische deling

    • Behoud van de geïmmortaliseerde staat

    • Blokkade van differentiatie

Wanneer een cel Oct 4 tot expressie brengt, is het een stamcel. Wanneer de Oct 4 positieve cel wordt blootgesteld aan een factor die hem kan initiëren, blijft hij Oct 4 tot expressie brengen en blijft hij zich dus delen. Er vindt promotie plaats. Op een gegeven moment komt er een tweede mutatie bij en wordt het een kankercel.
Genetisch toxiciteit:
Genetische toxicologie = genotoxicology.

Genotoxische angentia = Alle chemische, fysische en biologische factoren die permanente of reversibele veranderingen in het genetisch materiaal veroorzaken.
In het DNA:

C-G bindingen hebben 3 H bruggen.

A-T bindingen hebben 2 H bruggen.

Zo herkennen ze elkaar.

Verder bevat het DNA fosfolipiden en suikergroepen.
Mutagenese = DNA-schade

Er ontstaan mutaties door deletie, additie of transformatie



Clastogenese = chromosoomschade

DNA ketens breken en de delen worden verkeerd aan elkaar gezet of gaan verloren.



Aneugonese = verandering in het aantal chromosomen

Chromosomen worden ongelijk verdeeld over de dochtercellen tijdens de replicatie.


Oorzaken van mutaties:

  • Elektrofielen

    • Direct

    • Na bioactivatie

  • Radicalen

    • Bioactivatie

    • Straling

  • Straling

Ze regeren met N of O van de base (want deze plekken zijn nucleofiel) of de O van de fosfaatgroep. Ook kan er cross-linking van DNA ketens en DNA breuk ontstaan. Dit leidt ertoe dat er een verkeerde base in het DNA komt of dat er intercalatie ontstaat.


Elektrofiele reactieve metabolieten: covalente binding van benzo-a-pyreen aan guanine.

4 OH groepen komen aan een van de beenzeenringen van benzo-a-pyreen te zitten door oxidatie en epoxide hydrolisatie. Er ontstaat hierdoor een reactieve metaboliet. Deze bindt met de G (guanine) van het DNA. Dit aanhangsel heet een adduct.


Alkylering van guanine:

Het adduct komt aan de =O van guanine. Hier komt een reactieve alkygroep aan vast. Deze O wordt normaal gebruikt voor de 3e waterstofbrug, dus deze derde brug kan niet gevormd worden. In plaats van met C bindt het met 2 waterstofbruggen een T. Het DNA wordt dus anders en er heeft een mutatie plaatsgevonden.


DNA adducten:

  • Sommigen leiden tot mutatie, anderen niet.

  • Ze zijn aantoonbaar, dus het is een biomarker voor blootstelling.

  • Sommigen ondergaan snelle reparatie.

  • Het is een premutagene lesie, want er ontstaat pas een verandering in het DNA als het DNA zich gaat delen.

  • Detectie vindt plaats d.m.v. radioactiviteit, GC-MS, HPLC, immunoassays of fluorescentie technieken.

UV geïnduceerde ROS productie resulteert in dimeer vorming van thymidine (T).

2 T’s die naast elkaar zitten plakken aan elkaar en worden gelezen als 1 T. Er wordt dus een base overgeslagen bij de transscriptie. Waar in het DNA dit gebeurt, bepaalt wat het effect is.
Oxidatieve schade aan het DNA gebeurt dus door ROS, maar het kan ook door geneesmiddelmetabolisme, endogene processen in de mitochondriën of UV straling (H2O  OH. + H.)

Het gevolg is het ontstaan van oxidatie producten of DNA-strengbreuk.


Mutaties door base analoga, broomuracil:

Base analoga = stoffen die lijken op DNA basen.

Broomuracil kan worden ingebouwd in het DNA alsof het een normale C of T base is. Het wordt dus ook als een van die twee basen gezien. Na een aantal bindingen krijg je hierdoor dat er een hele andere code gemaakt wordt.


Puntmutaties:

  • Frame shift: base toevoegen (additie) over verwijderen (deletie).

    • Intercalerende stoffen (stoffen die tussen de DNA strengen gaan zitten) als acridine, ethidiumbromide en doxorubicine

    • Gevolg: totaal andere genetische code, want als er 1 basepaar weg is of erbij komt, schuiven alle codons een stukje door en is bijna elk gevormd aminozuur anders.

  • Transformatie: vervanging van een base door een andere base.

    • Transitie: Een base wordt vervangen in dezelfde base of een base die niet tot een ander aminozuur leidt.

    • Transversie: Er ontstaat een ander aminozuur

      • chemische modificatie van een base (NO2, alkyl, nitrosaminen en vinyl chloride)

      • incorporatie van base-analogen (5Br-uracil)

    • Gevolg: bij replicatie wordt een verkeerde base ingebouwd

Na de replicatie worden de mutaties permanent. Dan is het ook niet meer herkenbaar als een fout. De mutatie wordt beperkt door reparatie voorafgaand aan de replicatie. Cellen die veel delen hebben dus meer kans op mutaties, omdat er minder tijd is om te repareren. Mutaties in het dominante allel hebben meer effect dan mutaties in een recessieve allel.


Gevolgen van een puntmutatie voor de expressie van een eiwit

  • Geen

    • Als het veranderde codon voor hetzelfde aminozuur codeert

    • Bij tijdige reparatie. (dit gebeurt heel veel)

    • Bij mutatie in een niet coderend of regulerende deel van het DNA

  • Gering

    • Verandering niet in een functioneel belangrijk deel van het eiwit.

  • Ernstig

    • Nonsense eiwit

    • Geen eiwit

    • Eiwit met veranderde functie  Leidt tot apoptose, maar het kan ook tot een permanent veranderde cel, kanker en teratogenese leiden.

Clastogenese (chromosoombreuk):

Door alkylerende stoffen:


  • Breuk van de DNA ketens

  • Crosslinking van DNA ketens

Door fouten tijdens de reparaties van transformaties.
Aneugenese (verstoring van de metafase):

Er is een verstoring van de segregatie van chromosomen tijdens de meiose of mitose. Dit leidt tot veranderingen in chromosomen of het aantal chromosomen.

Colchicine en vinblastine zijn hier bijvoorbeeld bij betrokken.

Bijv. het syndroom van Down, waarbij je 47 in plaats van 46 chromosomen hebt.


Heel veel mutagenen zijn carcinogeen (maar niet allemaal).

Niet alle carcinogenen zijn mutageen. Dit is dan meestal iets epigenetisch, bijvoorbeeld beïnvloeding van de reparatie, immunosuppressiva of promotoren).


Voor carcinogenese zijn er vaak meerdere mutaties nodig.
Ras gen: proto-oncogen.

Wanneer Ras geactiveerd wordt door carcinogenen, worden er groeifactoren, groeifactor receptoren, transscriptiefactoren en kinases upgereguleerd en gaat de cel versneld delen.


P53: tumorsuppressorgen.

Wanneer P53 wordt geremd door een carcinogeen, worden de intercellulaire communicatie, de remming op de celgroei en op de apoptose verminderd. De cel gaat dan ongeremd delen.



Non-genotoxische carcinogenen

Promotoren: stimuleren de groei van een geïnitieerde cel.



  • Immunosuppressiva remmen het herkennen en verwijderen van preneoplastische cellen.

  • Hormonen: bevorderen de celgroei.

  • Remmers van DNA reparatie: Voorkomen het verwijderen van gemuteerd of beschadigd DNA.

  • Proliferatoren: versnelde celdeling, meer kans op fouten, minder tijd voor reparatie van het DNA.

  • Cytotoxische stoffen: chronische schade.

  • Remmers van gap junctions (cel-cel communicatie).

Non-genotoxische stoffen zijn veel moeilijker op te sporen. Bij genotoxische stoffen kun je gewoon kijken of er DNA veranderingen zijn, maar bij non-genotoxische cellen moet je naar alle bovenstaande processen kijken.
Reparatie van mutaties:

  • Reparatie vóór de celdeling voorkomt kanker

  • Reparatie van modificaties zoals O6-methylguanine door repair-enzymen

  • Reparatie van transformaties door een set van enzymen, endonucleasen en DNA polymerases

  • Remming van de reparatie leidt tot een verhoogde frequentie van kanker (bijv. xeroderma pigmentosum)

Reparatiecapaciteit van verschillende organen:



  • hersenen: heel weinig

  • nier: redelijk veel

  • lever: heel veel

Geneesmiddelen testen op carcinogene eigenschappen:



  • bij chronisch of frequent gebruik

  • verdachte structuur

  • verdachte werking/klasse

  • verdacht/positief in de mutatie-test (als een stof mutageen is, wordt hij meestal niet verder ontwikkeld)

  • verdacht voor ophoping

Maar: toelating op de markt is afhankelijk van indicatie: in principe wordt een genotoxisch carcinogeen niet verder ontwikkeld, maar vele chemotherapeutica zijn carcinogeen want ze veroorzaken celdood en DNA schade. Omdat ze tegen levensbedreigende ziekten gericht zijn, worden ze toch verder uitontwikkeld.
Alkylerende stoffen zijn carcinogeen
Genotoxiciteitstesten:

  • Covalante binding aan DNA

  • DNA schade. DNA reparatietest: als er veel reparatie plaatsgevonden heeft, is er blijkbaar veel schade geweest.

  • Mutaties. Bijv. de AMES test

  • Aneuploidie

  • Schade aan chromosoom structuur

AMES test:

Een gemuteerde salmonella groeit alleen in een histidine medium. Je stopt ze in een histidine-vrij medium en je voegt je stof toe. Vervolgens kijk je of er een terugmutatie plaatsvindt. Dit gebeurt ook spontaan, maar als jouw stof voor meer terugmutaties zorgt, is de stof dus van zichzelf mutageen. Ook worden er een leverhomogenaat en cofactoren toegevoegd aan je stof zodat de metabolieten gevormd worden. Als je dan meer groei van de salmonella ziet, zijn er dus reactieve metabolieten gevormd van je stof.


Muis lymfoma TK-locus test.

  • In thymedine kinase (TK) wordt een mutatie aangebracht. Dit enzym is nodig voor de omzetting van thymidine monoP in thymidine triP.

  • Het kan ook BrdU (niet- toxisch) omzetten in BrdtriP (toxisch). Dit wordt namelijk ingebouwd in het DNA.

  • Een mutatie van TK+/- naar TK-/- maakt enzym onwerkzaam en er treedt dan geen toxiciteit op.

  • Je kijkt dus of je stof voor mutatie van TK zorgt.

Comet assay:

Cellen worden in een agarose gel geplaats op een microscopisch plaatje. Met alkaline lysis worden de cellulaire eiwitten verwijderd. Het DNA zal zich openen en er vindt elektroforese plaats. Intact DNA beweegt langzaam, maar kapot DNA gaat heel snel. Je staint het DNA en kijkt of een 1 grote stip is of dat er een staart van kapot DNA is. Hoe groter de staart, hoe meer DNA schade. Het wordt opgedeeld in 5 categorieën, namelijk van 0 (onbeschadigd DNA) tot 5 (zwaar beschadigd DNA)
Micronucleus-test:

Deze test vindt in vivo plaats.

Tijdens de celdeling kunnen de chromosomen beschadigen. Bij het verdelen van chromosomen over de twee dochtercellen blijft dit stukje chromosoom (= een microcnucleus) achter. De micronucleus kan worden aangekleurd en zo kun je kijken naar hoe veel micronuclei er zijn. Dit is het best zichtbaar in de erythrocyten, omdat deze geen kern hebben.
In vitro genotoxiciteitstesten


  • Er is een hele batterij van testen nodig om een volledig beeld te krijgen.

  • Er moeten altijd 1 of meer positieve controles en negatieve controles meegenomen worden.

  • Metabole activatie is belangrijk (enzymen + cofactoren)

  • Voorspelling van carcinogeniteit uit de genotoxiciteitstesten is nog onzeker.

Genotoxiciteitstesten voor geneesmiddelen:



  1. Mutaties. Bij bacterien: AMES test. Bij zoogdieren: TK locus test

  2. Chromosomale schade: in vitro test met zoogdiercellen, bijv. muis lymfoma TK-locus of de comet assay.

  3. In vivo chromosoomschade in knaagdier haematopoëtische cellen met de micronucleus test.

In vivo carcinogeniteitstesten:

  • Muizen en ratten

  • Ze worden hun hele leven (2 jaar) blootgesteld aan de stof

  • Er worden grote aantallen dieren gebruikt, mannen en vrouwen. (mannetjes en vrouwtjes hebben een andere hormoonhuishouding)

  • Er worden 3 doses gedaan. De hoogste dosis is net een beetje toxisch = maximaal getolereerde dosis = MTD. De middelste is 50% van de MTD en de laatste dosis is 10-25% van de MTD.

  • De toedieningsroute moet gelijk zijn aan de therapeutische toedieningsroute

  • Er is een extra groep voor de kinetiek. De blootstelling moet vergeleken worden met de blootstelling in de mens bij de therapeutische dosis. (en dus niet bij die hele hoge dosis)

Uitleesparameters bij de carcinogeniciteitstest in vivo:



  • Pathologie, classificatie

  • Wanneer er tumoren gevonden worden:

    • Genotoxisch: meestal niet op de markt

    • Epigenetisch: alleen op de markt toegelaten als het aannemelijk is dat het een speciesverschil is en het dus niet relevant is voor de mens of als de veiligheidsmarge (MOS) heel groot is.

Problemen bij carcinogeniteitstesten:



  • Carcinogeniteit van therapeutische eiwitten is moeilijk te testen in dieren wegens immunogeniteit. Ze zijn waarschijnlijk niet mutageen, maar ze kunnen wel evt. promotoren zijn.

  • Humaan: moeilijk aan te tonen, alleen mogelijk bij zeldzame kankers.

  • Sommige chemotherapeutica zijn zelf carcinogeen. Het therapeutisch effect is lastig te meten.

  • De muizen hebben vaak een hoge spontane tumor-incidentie.

  • Verschillen tussen muizenstammen.

  • Speciesverschillen zijn groot, dus wat is de voorspellende waarde?

Nieuwe ontwikkelingen:



  • Transgene muizen die eerder kanker krijgen (kortere proeven)

  • Muizen die extra gevoelig zijn

  • pasgeboren ratten

  • In vitro non-genotoxische carcinogeniteitstesten dmv. transcriptomics.


1   2   3   4   5   6


Dovnload 277.62 Kb.